Petit rappel

Arrêté du 26/04/02

Difficulté du groupage

Difficulté ABO

Cas pratiques

 

LES DIFFICULTES DU GROUPAGE SANGUIN

 

A -  PRINCIPES GENERAUX DU GROUPAGE SANGUIN

Les réactifs utilisés doivent être conformes aux caractéristiques et normes définies par la réglementation en vigueur, agréés par l'AFSSAPS et validées par le CNRGS qui attribue un certificat et un numéro attestant que le réactif est conforme. Le numéro CNRGS doit figurer sur les flacons. Le numéro du clone doit figurer sur la fiche technique et le flacon. A ce jour, le numéro AFSSAPS doit figurer sur l'emballage.

1) Groupage ABO

Chaque détermination de groupe sanguin ABO comporte 2 épreuves complémentaires réalisées simultanément :

- L'épreuve globulaire consistant à rechercher la présence des antigènes A et B avec les réactifs anti-A, anti-B et anti-AB.

- L'épreuve plasmatique consistant à rechercher les anti-A et anti-B avec des hématies-tests A1 et B. Des contrôles de qualité internes appropriés sont systématiquement utilisés.

Ces deux épreuves, doivent être réalisées en double par deux techniciens, en dehors du contexte d'automation légalement prévu.

2) Groupage RH1 (il est désormais indissociable du groupage ABO).

Chaque détermination de groupe RH1 comporte l'étude des hématies à l'aide d'un réactif " anti-RH1 + témoin ». Le réactif témoin étant de composition strictement identique au réactif anti­RH1 mais dépourvu de toute activité anticorps. Cette détermination doit être réalisée en double par 2 techniciens, en dehors du contexte d'automation légalement prévu.

3) Phénotypage RH-KEL1

La détermination du phénotype RH-KEL consiste à rechercher la présence ou l'absence des antigènes érythrocytaires : RH2, RH3, RH4, RH5 et KEL 1 à l'aide de réactifs de préférence monoclonaux avec les contrôles de qualité internes obligatoires.

4) Les contrôles qualités internes (COI)

Pour chaque série d'analyse, les réactifs utilisés pour la détection des antigènes érythrocytaires des groupes ABO-RH1 et RH-KEL1 seront testés vis-à-vis d'hématies-tests de groupe ABO-RH1 et RH-KEL1 connus. Ces contrôles seront réalisés quotidiennement dans les mêmes conditions techniques que celles des échantillons. Il sont précisément énoncés dans l'arrêté du 26 avril 2002.

B -  VALIDATION ANALYTIQUE DU TYPAGE  ERYTHROCYTAIRE

La validation analytique du typage érythrocytaire repose sur :

1) Les résultats conformes des CQI

2) L'absence d'ambiguïté réactionnelle avec chaque réactif

3) L'absence de double population

4) Un profil réactionnel cohérent

5) Absence de discordance entre deux réalisations

6) Absence de discordance avec des résultats antérieurs

Le groupe ABO: il sera conclu si le profil réactionnel correspond à la grille d' interprétation suivante :

Groupe

Anti-A

Anti-B

Anti-AB

H.T.A1

H.T. B

A

+++

-

+++

-

+++

B

-

+++

+++

+++

-

AB

+++

+++

+++

-

-

O

-

-

-

+++

+++

Les CQI comportent au minimum un échantillon de groupe A, B et O. Toute incohérence entre l'épreuve globulaire et l'épreuve plasmatique impose de ne pas valider le groupe sanguin, de rendre un conseil transfusionnel et d'explorer l'anomalie.

Témoin AUTO: plasma du sujet + hématies du sujet

Témoin AB : sérum AB (ou milieu de dilution du réactif) + hématies du sujet. Ce témoin, s'il est négatif, garantit l'épreuve globulaire.

Témoin ALLO : sérum du sujet + hématies-tests O. Ce témoin garantit, s'il est négatif, l'épreuve plasmatique.

Le groupe RH1 : il sera conclu si la réaction avec le réactif témoin est parfaitement négative. L'agglutination avec ce réactif témoignera de la sensibilisation préalable in vivo des hématies par un auto anticorps, un allo-anticorps, ou d'un phénomène de rouleaux.

Elle imposera de pratiquer un test direct à l'antiglobuline (DAT) et l'utilisation d'autres techniques ou réactifs pour le typage RH1. Ici encore, la détermination par 2 techniciens utilisant 2 lots différents de réactifs et témoins est actuellement obligatoire en dehors du contexte d'automation prévu par l'arrêté du 26 avril 2002.

Le phénotype RH-KEL1 : il sera conclu si la réaction avec le réactif témoin est parfaitement négative, les CQI valides et que les règles de l'antithétisme sont respectées. L'agglutination avec ce réactif témoignera là encore de la sensibilisation préalable in vivo des hématies par un auto ou un allo-anticorps, ou d'un phénomène de rouleaux. Elle imposera de pratiquer un DAT et l'utilisation d'autres techniques ou réactifs pour le phénotypage RH-KEL1.

 

C -  DIFFÉRENTES ANOMALIES OU DIFFICULTÉS

Toute anomalie impose de vérifier tout d'abord la conformité des réactifs utilisés avec l'analyse des résultats obtenus avec les contrôles de qualité internes, leur aspect et leur date de péremption. La constatation d'anomalie impliquant les réactifs impose une destruction de ceux-ci et une reprise de l'analyse avec d'autres réactifs conformes. De même, quel que soit le type d'anomalie constatée, il faudra vérifier l'absence d'une altération de la qualité de l'échantillon de sang à tester. Un prélèvement hémolysé (n'ayant pas été conservé dans des conditions de température optimale) ou ancien impose de prélever un nouvel échantillon de sang au patient.

I. Résultat invalide

a. Réaction ambiguë : agglutination faible ou infra détectable

• Contextes particuliers

Nouveau-né

Les antigènes des systèmes ABO et associés subissent une maturation post natale. La densité antigénique à la naissance est donc inférieure à celle des hématies de réactivité « adulte » acquise aux alentours de 2 ans. L'intensité réactionnelle d'agglutination peut donc varier d'un réactif à un autre lors du typage de ces hématies. Le document de groupage sanguin établi à cette occasion n'a qu'une valeur provisoire, pendant une durée de six mois.

Affaiblissement antigénique chez certains sujets âgés

Un affaiblissement antigénique peut être observé chez certains sujets âgés, en dehors de toute pathologie particulière.

Phénotype « B » acquis

A la faveur d'une infection, volontiers de type surinfection d'un cancer colique, les hématies de patients de groupe sanguin A1 essentiellement, voient sous l'action d'une dé-acétylase d' origine bactérienne, leur sucre immuno-dominant la N-acétylgalactosamine, se transformer en galactosamine (structure proche de l'antigène B dont le sucre immuno-dominant est un galactose) que reconnaissent certains anti-B polyclonaux et quelques monoclonaux mal sélectionnés (caractéristique devant être précisée par le producteur). Ce phénomène est transitoire et le groupe A du patient pourra bien être confirmé à distance de l'épisode infectieux.

Phénotypes A faibles et B faibles

Les phénotypes A faibles et B faibles définissent des hématies dont la réactivité antigénique est inférieure à celle des hématies A2 et B « normales ». Dans certains cas, l'agglutination peut être extrêmement faible et la présence des antigènes A ou B ne peut être confirmée que par une technique de fixation-élution. Après confirmation sur un 2ème prélèvement, il convient d'établir un document de groupage sanguin faisant état de ce phénotype particulier et indiquer une attitude transfusionnelle adaptée.

Phénotypes faibles dans les autres systèmes

La présence de phénotypes faibles dans les autres systèmes peut être observée à l'occasion de typage érythrocytaire dans d'autres systèmes de groupes sanguins. L'un d'entre eux est particulièrement important à déceler : l'antigène RH 1.

b. Double population

Une image de double population est caractérisée par la présence d'agglutinats sur fond rosé d'hématies libres. La réalité de cette image doit être vérifiée au microscope. Elle peut être liée à l'existence de deux populations d'hématies possédant des antigènes différents (post transfusionnelle...) ou au comportement particulier des cellules en présence de certains réactifs (phénotype A3 ... ).

*Double population dans le système ABO

Présence d'un contexte clinique particulier

Contexte transfusionnel

La double population est liée à la durée de survie des hématies transfusées Le plus souvent, il s'agit d'une transfusion non isogroupe compatible, mais il ne faudra pas méconnaître l'incompatibilité majeure ABO liée à une erreur transfusionnelle. Après avoir vérifié le groupe sanguin ABO-RH1 des hématies transfusées, il convient d'établir un document provisoire de groupe sanguin en précisant la conduite transfusionnelle. Lorsque la quantité de sang transfusé est importante, les hématies du patient peuvent être masquées : c'est notamment le cas après transfusions in utero ou exsanguino-­transfusions à la naissance.

Prélèvement de sang de cordon

La double population est liée à l'existence d'hématies maternelles et néo-fœtales. Un prélèvement de sang veineux est alors nécessaire.

Contexte de greffe de cellules souches hématopoïétiques non ABO identique

La double population est transitoire et le témoin d'une « prise » de la greffe en période post greffe immédiate. Cette image pourra ensuite disparaître complètement avec un remplacement progressif des hématies du receveur par celles du donneur. La réapparition d'une image de double population à distance de la greffe est le témoin de la réapparition de la moelle du receveur donc d'une rechute de sa maladie. Après avoir vérifié les groupes sanguins ABO-RH1 du donneur et du receveur, il convient d'établir un document particulier en indiquant une attitude transfusionnelle adaptée.

Sujet âgé sans pathologie particulière

Contexte d'hémopathie maligne

Certaines hémopathies malignes s'accompagnent de l'affaiblissement antigénique des hématies issues des clones pathologiques. La double population évolue avec la maladie en disparaissant en cas de rémission et réapparaissant en cas de rechute. Après confirmation sur un deuxième prélèvement, il faut établir un document immuno­hématologique provisoire avec une attitude transfusionnelle adaptée.

Contexte de gémellité

Une double population vis à vis de plusieurs marqueurs peut être observée chez des jumeaux dizygotes en raison de la greffe naturelle de cellules souches hématopoïétiques pendant la vie embryonnaire. Après avoir analysé le phénotype de l'autre jumeau et mis en évidence plusieurs doubles populations, il faut établir un document immunohématologique faisant état de cette chimère hématopoïétique et indiquer une attitude transfusionnelle adaptée.

 

Absence de contexte clinique particulier : phénotypes A faible et B faible

Les phénotypes A faible et B faible définissent des hématies dont la réactivité antigénique est inférieure à celles des hématies A2 et B "normales". Certains de ces phénotypes peuvent donner des images de double population sans que celle ci soit réellement séparable (phénotype A3), alors que d'autres sont de véritables mosaïques génétiquement transmises caractérisées par la présence de cellules porteuses de l'antigène A et d'autres non porteuses de ce même antigène (phénotype A end). Après confirmation sur un deuxième prélèvement, il convient d'établir un document de groupe sanguin faisant état de ce phénotype particulier et indiquer une attitude transfusionnelle adaptée.

• Double population dans les autres systèmes de groupes sanguins

Dans les autres systèmes de groupes sanguins, des doubles populations peuvent être observées. Les causes principales se rapprochent de celles décrites pour le système ABO avec notamment la transfusion, la greffe de cellules souches hématopoïétiques et la gémellité dizygote. La conduite est identique aussi bien en terme d'exploration étiologique que d'établissement de documents spécifiques.

II. Résultat incohérent

a) Discordance entre les épreuves globulaire et plasmatique du groupe sanguin ABO

• Réactions par excès

Une réaction d'agglutination est constatée alors qu'elle n'était pas attendue par la logique de l'interprétation des résultats du groupage sanguin. Elle peut survenir à l'épreuve globulaire ou plasmatique.

A l'épreuve globulaire : en fonction des réactions observées avec les témoins réglementaires, 3 groupes principaux d'hypothèses pourront être évoqués.

Anomalies des réactifs : les réactions observées avec le sérum AB (ou milieu de dilution d'un réactif monoclonal) et le témoin autologue apparaissent négatives. Deux hypothèses principales peuvent être évoquées : une contamination des sérums-tests qu'elle soit accidentelle ou en rapport avec un anticorps supplémentaire présent dans un réactif polyclonal ou un phénomène de type B (A) constaté avec certains anti-B monoclonaux très puissants et mal sélectionnés, capables de détecter de petites quantités d'antigène A sur une hématie réellement de groupe B.

Anomalies globulaires : les réactions avec le sérum AB apparaissent positives alors que le témoin autologue est négatif L'hypothèse d'une polyagglutinabilité est alors évoquée. Une hématie polyagglutinable est agglutinée par des sérums humains adultes, immunologiquement normaux, compatibles ABO et dépourvus d'allo-anticorps. Cette agglutination est généralement liée à l'expression d'un antigène cryptique ou transformé contre lequel des anticorps naturels existent dans la majorité des plasmas humains. La révélation de ces antigènes globulaires étant le plus souvent le fait d'une pathologie infectieuse (T ou B acquis) ou maligne (Tri).

Anomalies plasmatiques : la positivité des réactions observées avec le sérum AB (ou le milieu de dilution d'un réactif monoclonal) et le témoin autologue apparaissent en rapport avec la présence d'un auto-anticorps plasmatique responsable de la sensibilisation des propres hématies du sujet.

A l'épreuve plasmatique : l'observation d'une réaction non attendue à l'épreuve plasmatique impose de pratiquer le témoin allo et en cas de positivité de tester le plasma vis à vis d'une gamme d'hématies-tests d'identification dans les mêmes conditions techniques que celles du groupage. En fonction des réactions observées, plusieurs hypothèses peuvent être évoquées :

  1. le témoin allo est négatif: dans ce cas l'anomalie par excès est due soit à la présence d'un anticorps dirigé contre un antigène de faible fréquence (rare), ou encore à la présence d'un anticorps reconnaissant les antigènes A1, A ou B (Anti-A1, anti-A ou anti-B que ce soient des auto-anticorps, des allo­anticorps ou des anticorps passifs).
  2. Le témoin allo est positif: il convient alors d'identifier l'anticorps et de pratiquer l'épreuve plasmatique avec des hématies-tests dépourvues de l'antigène correspondant à l'anticorps identifié,

 

  1. Enfin, toutes les hématies testées sont agglutinées en raison de la présence d'un auto-anticorps (témoin autologue positif) ou d'un anticorps dirigé contre un antigène public (anti-H chez un sujet de phénotype H déficient... ).

• Réactions par défaut

Une réaction d'agglutination attendue par la logique de l'interprétation du groupage sanguin ABO n'est pas observée. Elle peut survenir à l'épreuve globulaire ou plasmatique.

A l'épreuve globulaire : avant d'évoquer les hypothèses classiques, il convient de valider l'anomalie, à savoir, confirmer l'absence d'agglutination attendue et ne pas la confondre avec une hémolyse des hématies du sujet par l'action de réactifs mal conservés.

Contexte clinique particulier : l'absence d'agglutination attendue à l'épreuve globulaire peut être liée à l'absence ou à la faible maturation néo­natale des antigènes ABO ou à la disparition progressive de ceux ci à la suite d'une hémopathie maligne. De même, on peut observer des sécrétions pathologiques de substances solubles de groupes sanguins ABO dans les kystes ovariens et les cancers des organes digestifs. En raison de la quantité importante de substances de groupe produites et déversées dans le plasma, il peut y avoir inhibition d'hémagglutination en cas d'utilisation de réactifs polyclonaux, mais aussi avec certains monoclonaux. Dans ces conditions, la reprise d'une épreuve globulaire après lavage des hématies permet de lever l'anomalie.

En l'absence de contexte clinique particulier : on évoquera la possibilité de phénotypes ABO faibles dont la présence des antigènes ne pourra être détectée que par des techniques sensibles de type fixation-élution.

A l'épreuve plasmatique : ici aussi, il conviendra avant d'évoquer les hypothèses classiques, de valider l'anomalie, c'est-à-dire de confirmer l'absence d'agglutination, à ne pas confondre avec une hémolyse des hématies-tests par l'action des hémolysines anti-A ou anti-B présentes dans le plasma du patient.

L'absence des anticorps attendus pourra être observée dans cinq contextes différents chez :

-         le nouveau-né : il s'agit d'un état physiologique d'immuno-immaturité,

-         le sujet âgé immuno-déprimé,

-         le sujet atteint d'hypo-gammaglobulinémie ou d'agammaglobulinémie congénitale ou acquise (traitement immunosuppresseur, myélome, Waldenstrôm, LLC ... ),

-         le receveur de cellules souches hématopoïétiques,

-         les jumeaux dizygotes en cas de greffe réussie de cellules hématopoïétiques pendant la vie intra-utérine.

b) Réaction témoin positive

La réalisation de tout typage érythrocytaire comporte obligatoirement l'utilisation d'un sérum-test contenant l'anticorps spécifique de l'antigène à rechercher et d'un réactif témoin négatif de composition strictement identique au sérum-test fourni par le même producteur mais dépourvu d'activité anticorpale. Toute réaction positive constatée avec le réactif témoin remet en cause la validation du typage érythrocytaire et en particulier toute réaction positive constatée avec le sérum-test. On conçoit le risque transfusionnel ou obstétrical notamment en ce qui concerne l'antigène RH 1, de valider par erreur sa présence chez un receveur de produits sanguins labiles ou chez une femme RH : -1 non immunisée anti-RH 1 venant d'accoucher d'un enfant RH 1.

La positivité d'une réaction avec le réactif témoin peut parfois être le fait d'un phénomène de rouleaux, constaté dans certaines pathologies lympho­prolifératives où l'excès de synthèse d'immunoglobulines est responsable d'un empilement en « pile d'assiette » des hématies qui est facilement distingué au microscope, d'une réelle agglutination. La réalisation du typage après lavage des hématies permettra de lever cette incohérence et de valider le groupage.

Le plus souvent, la positivité d'une réaction avec le réactif témoin est le fait d'une sensibilisation in vivo des hématies dont les étiologies sont les suivantes :

- maladie hémolytique du nouveau-né,

-         incident immunologique de transfusion sanguine,

-         anémie hémolytique auto-immune,

- anémie hémolytique immuno-allergique.

Il conviendra dans ces situations de réaliser les typages avec 2 lots différents d'anticorps monoclonaux de nature IgM utilisables en milieu salin.

c) Absence de deux antigènes antithétiques

La majorité des systèmes de groupes sanguins possède des phénotypes rares dits silencieux ou « nul » caractérisés le plus souvent par l'absence de deux antigènes antithétiques. Deux antigènes sont dits antithétiques quand l'absence de l'un implique forcément la présence de l'autre comme cela est expliqué dans l'exemple ci-dessous :

-         si RH2 est absent alors RH4 est forcément présent

-         si FYl est absent alors FY2 est forcément présent.

Phénotypes silencieux du système RH

Pour les phénotypes partiellement silencieux du système RH, il peut y avoir absence à la fois :

-    des antigènes RH3 et RH5 et la délétion partielle est notée RH : 12-3-4-5,

- des antigènes RH3, RH5, RH2 et RH4 et la dé délétion partielle est notée RH : 1-2-3-4-5.

Pour les phénotypes totalement silencieux ou RH « nul », il y a absence de tous les antigènes du système RH et le phénotype est noté RH : -1-2-3-4-5.

Exemples de phénotypes silencieux dans les autres systèmes de groupes sanguins

- FY : -1 -2 du système FY, - JK : -1 -2 du système JK.

La problématique posée par ces phénotypes silencieux est liée à l'absence d'antigènes dits publics (portés par la majorité des individus) et la possibilité de posséder les anticorps correspondants, soit de manière naturelle (anti-H des sujets hh et sese) ou allo-immune (anti-FY3 des FY : -1, -2, anti-JK3 des JK : - 1, -2) avec les conséquences obstétricales et transfusionnelles qui s'y rattachent.

 

III. Discordance entre deux réalisations

Les résultats sont relus par une tierce personne. En cas de confirmation des résultats, l'analyse est reprise avec d'autres réactifs ou dans d'autres conditions techniques. En cas de persistance de l'anomalie, l'analyse est transmise à un laboratoire spécialisé. En effet, en fonction des réactifs utilisés, la constatation d'une divergence entre deux réalisations peut être liée à des phénotypes particuliers, comme c'est le cas pour l'antigène RH1 par exemple : la divergence de résultat entre deux réalisations peut être liée à deux particularités phénotypiques caractérisant cet antigène :

a. Antigène RH1 faible

Il s'agit d'un déficit quantitatif et global d'antigènes RH 1 à la surface de l'hématie dont la détection est directement liée au seuil de sensibilité de la technique utilisée et à la performance des réactifs mis en oeuvre. Ces hématies peuvent être alors étiquetées RH : -1 en technique de routine alors que la mise en oeuvre de techniques plus sensibles peut détecter la présence de l'antigène à leur surface. Si cette situation n'a pas d'incidence chez le receveur de produit sanguin qui sera transfusé en RH1, elle peut avoir des conséquences cliniques plus importantes si un antigène RH 1 n'est pas décelé sur un don de sang et chez un nouveau-né issu d'une mère RH : -1.

La technique traditionnelle est le test indirect à l'antiglobuline qui doit être pratiqué selon les mêmes règles que le typage RH1 standard. Cependant, cette organisation n'est pas satisfaisante, car le groupage des hématies des sujets de phénotype RH1 faible est effectué en 2 étapes. L'utilisation conjointe de réactifs monoclonaux sélectionnés pour leur performance vis-à-vis des phénotypes RH1 normaux et affaiblis, associés aux nouveaux procédés comme la filtration et à l'utilisation d'enzyme protéolytique (broméline) permet d'augmenter la sensibilité du test et de détecter les variants RH1 faible en une seule étape.

 

b. Antigène RH1 partiel

L'antigène RH1 est constitué d'une mosaïque de sous unités toutes présentes chez le sujet RH1 et toutes absentes chez le sujet RH : -l. Chez certains sujets, un ou plusieurs épitopes peuvent être manquant et définir le variant RHI partiel . La transfusion de ces sujets avec du sang RH1 (ou une grossesse incompatible) est susceptible d'entraîner une allo immunisation anti-RH1 vis-­à-vis des épitopes qui leur font défaut. Certains de ces phénotypes s'expriment avec une antigénicité subnormale (RH1 partiel VII), d'autres s'expriment avec une antigénicité affaiblie du fait d'un déficit quantitatif associé (RH1 partiel VI). Il semblerait que ce soit ces derniers qui s'immunisent le plus facilement, aussi il serait peut être judicieux d'utiliser, pour le groupage des receveurs, au moins un anti-RH1 ne reconnaissant pas le variant RH1 partiel VI (cette caractéristique sera précisée sur la notice du fournisseur).